在上一篇文章中(聲光偏轉(zhuǎn)器（AODF）在高速細(xì)胞分選中的關(guān)鍵作用：ICS技術(shù)簡介)，我們學(xué)習(xí)了發(fā)表在Science上的“High-Speed Fluorescence Image-Enabled Cell Sorting”，其中通過AODF實現(xiàn)了一種基于高速熒光成像的細(xì)胞分選技術(shù)。而這份速度是由FIRE高速熒光成像系統(tǒng)帶來的，即使用射頻標(biāo)記發(fā)射的熒光成像系統(tǒng)。最初是由來自加州大學(xué)洛杉磯分校的Eric D. Diebold, Brandon W. Buckley等四位科學(xué)家于2013年發(fā)表于Nature Photonics的“Digitally synthesized beat frequency multiplexing for sub-millisecond fluorescence microscopy”這篇論文中提及。

FIRE技術(shù)（fluorescence imaging using radiofrequency-tagged emission）是將一種射頻通信的方法應(yīng)用于高速熒光顯微鏡，同時結(jié)合了PMT的靈敏度和速度優(yōu)勢，并利用頻域信號復(fù)用、射頻頻譜數(shù)字合成以及數(shù)字鎖相放大，實現(xiàn)了千赫茲幀率的熒光成像，解決了EMCCD或者sCMOS用于流式細(xì)胞術(shù)速度不足的問題。而FIRE的核心特征在于樣品上每個單獨點均能夠以不同射頻激發(fā)熒光。在兩束移頻激光之間干涉所產(chǎn)生的拍頻處，數(shù)字合成的射頻“標(biāo)記”了熒光發(fā)射的各個像素點。這和無線通信系統(tǒng)中的頻率多路復(fù)用類似，F(xiàn)IRE圖像的一行內(nèi)的每個像素點都被分配了自己的射頻。單元光電探測器同時檢測多個像素的熒光，并從探測器輸出的頻率分量中重新構(gòu)建圖像（運用數(shù)字域的并行鎖相放大來分辨）。

樣品中每個點能以不同的射頻來激發(fā)熒光的秘訣在于其中的馬赫-曾德爾干涉儀（MZI），并使用聲光器件來執(zhí)行拍頻激發(fā)多路復(fù)用。如上圖a所示，MZI一路的光通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AODF）產(chǎn)生頻移（帶寬為100MHz），由射頻頻率梳驅(qū)動，相位經(jīng)過設(shè)計以最小化峰值-平均功率比。AODF產(chǎn)生多個偏轉(zhuǎn)光（+1級衍射光），包含一系列的偏轉(zhuǎn)角度和頻率偏移。MZI干涉儀第二路光通過聲光移頻器（AOFS），該移頻器由單個射頻頻率驅(qū)動，提供本振（LO）光束。使用柱面透鏡來匹配LO光束與射頻梳光束的發(fā)散角。在MZI干涉儀輸出的位置，兩束光通過分束器合并聚焦到樣品的一條水平線上，將頻率偏移映射到空間。

熒光在由干涉儀兩路的差頻所定義的各個拍頻下被激發(fā)。樣品中的熒光發(fā)射由共聚焦配置的PMT檢測，并且通過狹縫來排除平面外的熒光發(fā)射。共振掃描振鏡（RS）在橫向上進(jìn)行高速掃描，即可以二維成像。考慮到熒光團(tuán)的有限頻率響應(yīng)，選擇LO光束的頻移將拍頻激發(fā)頻譜外差到基帶，以最大限度利用調(diào)制帶寬。這是必要的，因為AOD通常在升頻的次倍頻通帶上工作，以避免諧波干擾。用于驅(qū)動AOD的射頻頻率梳的直接數(shù)字合成（DDS）定義了每個像素的激發(fā)，而這是通過特定的射頻和相位決定的，從而導(dǎo)致射頻頻率梳與檢測信號之間的相位相干性。而這種相位相干性可以使用相敏數(shù)字鎖相放大器的并行陣列使得圖像多路分解，這可以在Matlab中實現(xiàn)。FIRE的并行讀出將導(dǎo)致最大像素速率等于AODF的帶寬。

圖2顯示了FIRE顯微鏡的典型輸出。檢測到的時域信號(圖2a)是來自一排像素的射頻標(biāo)記發(fā)射的傅里葉疊加。使用短時傅里葉變換計算的時間分辨頻譜(圖2b)揭示了樣本在水平行內(nèi)位置相關(guān)的頻率成分。而樣本的垂直位置是從2.2KHz共振掃描鏡的參考輸出中恢復(fù)出來的，最終形成了二維的圖像（圖2c）。

在這里AOD有三項指標(biāo)至關(guān)重要，可分辨點數(shù)（掃描角度），功率平坦化，掃描速度。AOD的帶寬越大，自然掃描的角度也越大，可分辨的點數(shù)也越多。掃描時間意味著不同頻率間切換的時間，自然也和成像的速度息息相關(guān)。而功率平坦化是AOD晶體和驅(qū)動器共同優(yōu)化的結(jié)果，為了在掃描的帶寬內(nèi)獲得近似的衍射效率，不會使得掃描獲得的線性激光陣列中間亮兩邊暗，提供均勻的激發(fā)光。

G&H聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）可以提供適用于不同波長的型號，在不超過幾度的范圍內(nèi)，分辨出成百上千個點，掃描時間可以快至幾微秒。G&H為AOD提供光束的精確空間控制，無論是執(zhí)行1D或2D掃描還是執(zhí)行固定角度的光束偏轉(zhuǎn)。我們的聲光偏轉(zhuǎn)器可在整個掃描角度上提供高度均勻的衍射效率，并為材料處理和數(shù)字成像等掃描應(yīng)用提供一致的功率通過量。